PKH67细胞连接试剂盒（用于常规细胞膜标记）

产品关键词：

PKH67；PKH26；Calcein AM钙黄绿素；PKH67；CFDA SE；In vivo cell tracking体内细胞示踪；Sigma MINI26；Phanos Technologies；

产品信息

【好消息】：应客户的要求，我司对试剂盒内的Diluent C可单独供应，产品信息如下：

产品描述

PKH67细胞连接试剂盒（用于常规细胞膜标记）（PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling）是一款基于荧光探针PKH67，用于常规细胞膜标记的检测试剂盒，适用于体外细胞标记，体外细胞增殖以及长期的体内细胞跟踪研究等。

PKH67是一种专利的膜标记探针，与PKH1和PKH2相比，结构上带有更长的脂肪族碳尾，能稳定插入细胞膜脂质区域。正因具更长碳尾，内部数据连续性证明：PKH67具有比PKH2更低的细胞-细胞间转运发生。PKH67呈绿色荧光（见图1），最大激发波长为490nm，最大发射波长是502nm，与标准荧光素（Fluorescein）滤片兼容。PKH67非常适合用于细胞毒性实验，与碘化丙啶（PI，MX4205）或7-氨基放线菌素D（7-AAD，MX4215）这些细胞活力探针联合使用，或者与橙-红色荧光探针比如藻红蛋白（PE，MX4698）、红色荧光蛋白（RFP）等结合使用。根据染料稀释原理，PKH67常用于细胞增殖监测分析，包括抗原特异性的前体频率和带干细胞特性的静息/缓慢分化肿瘤细胞的鉴定。也能用于监测外泌体或脂质体吞噬，细胞-细胞膜转运、吞噬、抗原递呈，以及体内细胞运输研究。

以不分裂细胞为研究对象，通过对体外细胞膜滞留周期和体内荧光强度减弱频率的关联性分析，预测PKH67的体内荧光半衰期为10-12天。这与PKH1和PKH2的体内半衰期相近，这两个探针都成功用于监测周期长达1-2个月的体内淋巴细胞和巨噬细胞运输研究，因此，PKH67适用于需要绿色荧光细胞连接染料的短-中期体内示踪研究，以及体外细胞毒性、吞噬、增殖、抗原递呈，或其它共培养实验。

稀释液C（Diluent C）是本试剂盒配套提供的一种水溶性溶液，特别设计的一种标记媒介能维持细胞活力，同时最大化染料溶解性和标记过程中的染色效率。Diluent C对哺乳动物细胞来说是等渗的，不含去污剂或有机溶剂，也不含生理盐和缓冲剂。根据细胞类型，染料标记后膜的内在化程度，标记细胞可能呈现不同的状态，从明亮，到均匀点状或斑驳状。然而，PKH67荧光在生理范围内不依赖于pH，且每个细胞的荧光强度通常不受染料位置的影响。

图1. PKH67的激发和发射光谱图

我司（懋康生物）提供三种规格的PKH67细胞连接试剂盒（用于常规细胞膜标记），其中：

Mini Kit（CAT#：MX4023-100UL）建议用于小量或初步研究。当使用2ml染色体积（含2μM终浓度的PKH67），本试剂盒含有足量的染料用于检测25次细胞样本（2×107个细胞/次），和足量的Diluent C用于5次细胞样本（2×107个细胞/次）。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

Midi Kit（CAT#：MX4023-200UL）适用于中量研究，比如体外细胞增殖或毒性研究。当使用2ml染色体积（含2μM终浓度的PKH67），本试剂盒含有足量的染料用于检测50次细胞样本（2×107个细胞/次），和足量的Diluent C用于30次细胞样本（2×107个细胞/次）。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

Maxi Kit（CAT#：MX4021-500UL）适用于大量或体内研究。当使用2ml染色体积（含2μM终浓度的PKH67），本试剂盒含有足量的染料用于检测125次细胞样本（2×107个细胞/次），和足量的Diluent C用于30次细胞样本（2×107个细胞/次）。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

产品包装

保存与运输方法

保存：2-8oC避光保存，1年有效。其中组分A（PKH67 Dye）需严格避光，盖子保持拧紧。

运输：冰袋运输。

注意事项

1. PKH67是以溶于乙醇的储存液形式提供，保存的过程中需避光并拧紧盖子，以防止溶液挥发引起的染料浓度提高。使用前需检查是否有结晶，若有结晶，需在37℃水浴溶晶，超声或涡旋直至完全溶解。

2. Diluent C使用前需置于室温回温之后再配制标记用的细胞和染料工作液。Diluent C是无菌溶液，不含任何防腐剂或抗生素，使用和保存过程中都注意无菌。

3. PKH67不能保存在Diluent C内，保存在Diluent C的染色工作液需在使用前配制，现配现用。

4. 荧光染料均存在淬灭问题，操作和储存过程中需注意避光，以减缓荧光淬灭。

5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

操作步骤

1. 自行准备仪器和试剂（试剂盒不提供，用于常规细胞膜标记）

﹒良好分散，均匀的单细胞悬液（悬浮于组织培养基）

﹒含血清的组织培养基（完全培养基）

﹒不含Ca2+、Mg2+和血清的培养基，或生理盐溶液（比如，DPBS或HBSS）

﹒血清，白蛋白或其他系统兼容的蛋白

﹒聚丙烯锥底离心管（4-15ml）

﹒能控温的离心机（高达1000×g）

﹒荧光分析用仪器（荧光酶标板，荧光或共聚焦显微镜，流式细胞仪）

﹒无菌层流净化罩

﹒血球计数板或自动细胞计数装置

﹒载玻片和盖玻片

2. 常规细胞膜标记

【染色流程】：

以下操作流程使用2ml最终染色体积，含2μM PKH67，以及1×107个细胞/ml。

以下所有步骤都在室温下进行（20-25℃）。

1. 取一锥底聚丙烯离心管制备2×107个细胞的单细胞悬浮液，用无血清培养基清洗细胞一次。

2. 400×g离心细胞5min，得到松散的细胞沉淀。

3. 细胞离心后，轻轻吸掉上清。注意不要移动任何细胞并且残留不超过25μl上清液。

4. 加1ml Diluent C到细胞沉淀中制备成2×细胞悬液，用枪轻轻吹匀以确保完全分散。不可涡旋和不可让细胞长期保留在Diluent C中。

5 染色前立即制备2×染色液（4μM in Diluent C）：通过将4μl PKH67乙醇储存液到1ml Diluent C中，充分混匀分散所得。

6. 快速加1ml2×细胞悬液（Step 1.4）到1ml2×染色液（Step 1.5），用枪立即混匀样本?；煸群笱镜玫降闹张ǘ仁?×107个细胞/ml和2μM PKH67。

7. Step 1.6中的细胞/染料悬液孵育1-5min，中间定期混合。染色过程非?？?，更长时间无任何益处。

8. 加入等体积（2ml）血清或其他适当蛋白溶液（比如1% BSA）终止染色，孵育1min允许结合多余的探针。

9. 20-25℃，400×g离心细胞10min，轻轻吸掉上清，确保不会移动细胞。用10ml完全培养基重悬细胞，转移到一个干净无菌的锥底聚丙烯离心管中，20-25℃，400×g离心细胞5min。然后用10ml完全培养基清洗细胞沉淀＞2次，以确保完全去除未结合染料。

10. 最后一步清洗后，用10ml完全培养基重悬细胞沉淀，用来评估细胞回收，细胞活力和染色强度。离心和重悬沉淀到一理想终浓度的活细胞悬液。

染色示例（来自文献资源）

1）文献来源：Kelly DM, ten Bokum AM, O'Leary SM, O'Sullivan MP, Keane J. Bystander macrophage apoptosis after Mycobacterium tuberculosis H37Ra infection. Infect Immun. 2008;76(1):351-360. doi:10.1128/IAI.00614-07

PKH67染色目的（MKBIO）：为了评估旁观者凋亡效应，靶向THP-1单核细胞用PKH67来标记，最终在荧光显微镜观察以确认标记是否成功。标记好的THP-1细胞（未感染的旁观者细胞量：0.5 × 105cells/ml），加入被H37Ra感染的THP-1巨噬细胞（感染效应细胞量：0.5 × 105cells/ml），接种到2孔的LabTek腔室玻片。效应巨噬细胞经H37Ra感染4h，之后剧烈清洗去除胞外细菌。之后与未感染的PKH67标记旁观者细胞共培养，37℃共培养24或48h。孵育后，上清液去除，细胞用2% PFA固定，然后用TUNEL TMR监测凋亡，细胞核用Hochest 33342复染。用荧光显微镜来评估绿色PKH67标记巨噬细胞的旁观凋亡效应。当某一个单细胞同时呈绿色（旁观者）和红色（凋亡），表明旁观者凋亡效应的存在。

Fig 2. Uninfected bystander apoptosis for macrophages that were in contact with infected macrophages. (A) Macrophages were infected for 4 h with M. tuberculosis strain H37Ra. Uninfected PKH67-labeled green THP-1 cells (0.5 × 105 cells/ml) were added to infected macrophages for 24 and 48 h. Adherent cells were then stained with Hoechst 33342 and with TUNEL TMR (red) to determine apoptosis levels. Superimposition of PKH67-labeled (green) bystander cell fields and TUNEL-positive (red) fields showed bystander apoptotic macrophages (orange). Nuclear staining (blue) (not shown) revealed the total number of cells per field. One representative field at a magnification of ×20 is shown. The arrows indicate apoptotic bystander macrophages. (B) Close-up of apoptotic bystander macrophage (arrow).

2）文献来源：Hellberg L, Fuchs S, Gericke C, et al. Proinflammatory stimuli enhance phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes. ScientificWorldJournal. 2011;11:2230-2236. doi:10.1100/2011/413271

PKH67染色目的（MKBIO）：50ul肝素化全血用TLR-ligands和细胞因子刺激30min，之后，将1 × 106PKH67标记好的凋亡自体中性粒细胞加入全血中，置于37℃孵育。60min之后，红细胞用裂解液裂解掉，流式细胞术观察中性粒细胞内凋亡细胞的吞噬水平。

Fig 3. Phagocytosis of apoptotic neutrophils by neutrophils in whole blood. 50?μL heparinized whole blood was preincubated with the indicated stimuli for 30?min and, subsequently, 1 × 106 PKH67 stained apoptotic neutrophils were added. Phagocytosis was assessed after 60?min by using flow cytometry. (a) Effect of TLR-ligands on the phagocytosis rate. (b) Effect of various cytokines on the phagocytosis rate. Data show mean + SD from 3 independent experiments, *:P < 0.05. (c)–(f) Representative dot-plots for the quantitative assessment of ingestion of apoptotic cells by neutrophils in whole blood by using flow cytometry. (c) FSC/SSC gating of neutrophils. (d) Negative control: gated neutrophils without apoptotic cells. (e) neutrophil phagocytosis of PKH67-labeled (green) apoptotic neutrophils. (f) Neutrophil phagocytosis of PKH67-labeled (green) apoptotic neutrophils after exposure to Pam3CSK4.

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